Une histoire de seuil pas si anodine

Article rédigé le 3 avril 2020 suite à une publication par le Professeur Didier Raoult sur un prétendu effet du traitement hydroxychloroquine+/-azythromycine sur la charge virale suite à une infection au COVID-19.

Beaucoup a déjà été dit sur les études du Prof. Raoult quant à la possibilité d’utiliser un traitement faisant intervenir entre autres l’hydroxychloroquine. Étaient pointés du doigt par exemple l’échantillonnage dans la première étude et l’absence de contrôles dans la seconde.

Je me suis fait une autre réflexion qui pointe un élément clef à prendre en considération pour interpréter ces études et les comparées à la littérature scientifique : comment définit-on un patient qui est infecté ?

Quelle est la principale conclusion du Prof. Raoult ?

La principale conclusion du Prof. Raoult est : 5 jours après le début du traitement (hydroxychloroquine + azithromycine), 97,5% des patients sont négatifs (100% à 12 jours). Étant donné qu’en moyenne le traitement est pris 5 jours après l’apparition des symptômes, on peut dire que 97,5% des patients sont négatifs 10 jours après le début des symptômes (17 jours pour avoir 100% des patients).

Le Prof. Raoult compare ces valeurs à une étude rétrospective chinoise (publiée dans la revue the Lancet, avec en tout 191 patients, issus de deux cohortes) qui indique une durée de 20 jours après le début des symptômes pour qu’en moyenne les patients soient négatifs (avec des valeurs extrêmes de 37 jours). 10 jours contre 20 jours : le traitement serait efficace ! Notons qu’en l’absence de contrôles dans l’étude du Prof. Raoult, tout repose sur la comparaison avec cette étude.

Certains ont pointé du doigt le fait qu’il ne faut pas regarder que la charge virale mais aussi les symptômes après la chute de la charge virale. Mais ce premier résultat serait tout de même encourageant.

Comment définit-on un patient sans charge virale ?

Mais au fond, comment définit-on un patient négatif, sans charge virale ? On réalise se qu’on appelle une RT-PCR quantitative pour tester les patients dont on soupçonne une infection au coronavirus (COVID-19). Cette technique de biologie moléculaire existe depuis 1992 (la simple PCR existe depuis 1985). De quoi s’agit-il ?

A partir des prélèvements des patients, il s’agit d’extraire l’ARN viral (le patrimoine génétique du virus) puis de le transformer en ADN (c’est la reverse transcription ou RT). Ensuite, il s’agit de quantifier la quantité d’ADN viral : les positifs en ont beaucoup, les négatifs n’en ont pas.

Comment se passe cette quantification ? Pour répondre à cette question, voyons ce qu’est une PCR (Polymerase Chain Reaction). Le principe de la PCR est d’amplifier le nombre de fragments d’ADN. Pour ce faire il faut un enzyme (une protéine qui est chargée de cette amplification), des nucléotides (l’unité moléculaire de l’ADN : il en existe 4 types ; ce dont donc les briques pour construire l’ADN) et des amorces (elles  consistent en un assemblage de nucléotides qui reconnaissent de manière spécifique les fragments d’ADN qu’on souhaite amplifier, ils « disent » à l’enzyme où se placer pour amplifier l’ADN). La PCR consiste en série de cycles où la température change. Une première étape à 95°C permet de déshybrider l’ADN (l’ADN consiste en deux brins d’acide nucléique, qu’il faut ici séparer), une autre à 56-64°C pour que les amorces se lient aux fragments d’ADN d’intérêt (la température dépend de la séquence des amorces) et une troisième à 72°C où l’enzyme multiplie par 2 environ la quantité de fragments visés. Chaque cycle dure quelques minutes et on réalise 45 cycles. La quantité de fragments d’ADN viral est donc multipliée par 2 puissance 45, soit environ 35 000 milliards de fois ! Si un seul fragment d’ARN était présent dans l’échantillon, on en obtient donc à la fin 35 000 milliards.

Concrètement, l’équipe du Prof. Raoult a utilisé des amorces qui visent de manière spécifique un gène viral du génome du COVID-19 appelé « E gene », qui code pour une protéine de l’enveloppe du virus.

Dans le cas d’une mesure précise de la charge virale, une simple PCR ne suffit pas. On procède à ce qu’on appelle une PCR quantitative : dans ce cas on suit en direct au cours de la réaction (les 45 cycles) l’évolution de la quantité d’ADN dans le tube (en mesurant la fluorescence qui est ici corrélée à la quantité d’ADN). Si l’échantillon est positif (il y a beaucoup de fragments dès le départ), la quantité d’ADN augmente très rapidement. Au contraire, si l’échantillon est négatif (pas de fragment), la quantité d’ADN augmente très lentement (il est impossible avec ce genre de technique, avec des échantillons positifs testés en même-temps, de ne pas avoir d’augmentation du tout : il suffit d’un fragment dès le départ, qui peut être dû à une contamination, pour qu’on en ait 35 000 milliards à la fin).

 

 

Le graphe indique l’augmentation de la fluorescence au cours du temps pour différents échantillons au cours d’une PCR quantitative. On peut voir qu’il faut entre 5 et 10 cycles à l’échantillon rouge pour atteindre la valeur seuil A. Au contraire, il faut un peu plus de 35 cycles à l’échantillon mauve pour atteindre cette valeur. Ce sont ces nombres de cycles qui sont pris comme résultats de la PCR quantitative (appelés Ct). On voit à partir de cet exemple que l’échantillon rouge a au départ une plus grande quantité de fragments amplifiés (il atteint A plus vite) que le mauve (il faut plus de cycles pour y arriver).

Dans le cas des tests au coronavirus, les positifs auront des Ct faibles, les négatifs des valeurs élevées. Il faut ensuite définir le Ct limite : à partir duquel on dit qu’un échantillon est positif ou négatif. Quelque soit cette valeur, les très positifs ou les très négatifs ne feront pas débat. En revanche, les cas limites seront classés comme positifs ou négatifs en fonction de la valeur choisie.

Revenons au débat sur les études du Prof. Raoult

Si on lit le Matériel et Méthodes de l’étude publiée par le Prof. Raoult, le Ct pris pour définir les cas négatifs est 35. Cette valeur est une valeur élevée, conseillée comme limite pour ce genre de tests, on ne critiquera donc pas – dans l’absolu – cette valeur.

En absence de contrôles dans son étude, il faut en trouver dans d’autres études. Le Prof. Raoult compare lui-même ses données à l’étude rétrospective chinoise citée plus haut. Cette analyse regroupe des données issues de quatre institutions. J’ai pu trouver un article issu de l’une d’entre elles, the Chinese Center for Disease Control and Prevention. On remarquera que le Ct pris pour définir un patient négatif par les équipes de cet institut est de 40, soit plus élevé que celui pris par le Prof. Raoult. Ainsi le Prof. Raoult sous-estime la charge virale par rapport à ces derniers (plus le Ct est élevé, plus on a de positifs) ! La comparaison opérée par le Prof. Raoult (10 jours versus 20 jours pour une disparition de la charge virale) n’est pas possible.

On peut se rattacher à une étude publiée (avec seulement 18 patients, certes, et pas avec les mêmes amorces) sous la forme d’une lettre dans The New England Journal of Medicine. Si on prend comme valeur seuil la même que l’étude rétrospective chinoise (à laquelle le Prof. Raoult se compare, Ct = 40), il faut attendre environ 18 jours pour que les patients soient négatifs. En revanche, si on prend la même valeur que le Prof. Raoult (Ct=35), il faut attendre 12 jours pour que les patients soient négatifs : 10 jours contre 12 jours, est-ce que cette différence est significative ? Une  analyse plus précise de la courbe montre même un premier passage sous le seuil à 9 jours, avant un rebond à 11 jours. Aussi, en ce plaçant au dessous de 35, on peut passer à côté de ces rebonds.

Alors, que conclure ?

Le Prof. Raoult prétend annuler la charge virale 10 jours après le début des symptômes, en comparant ses données à de précédentes études qui montrent une annulation de la charge virale 20 jours après le début des symptômes. Nous avons vu que cette comparaison n’est pas possible car les deux études ne prennent pas la même définition de « patient négatif ». Et en prenant une étude qui permet la comparaison, il n’y a pas de différence.

Note ajoutée le 16 mai 2020 : le 14 mai est publiée une étude dans the British Medical Journal comprenant 150 patients (traités ou non à l’hydroxychloroquine seule, assignés à un groupe dès le début de l’étude de manière aléatoire, avec un traitement commençant en moyenne 16 jours après le début des symptômes), montrant une absence de différence statistiquement significative entre les deux groupes quant à la perte de la charge virale : en 28 jours (44 jours après le début des symptômes), 81-85% des patients sont négatifs ; la médiane du temps nécessaire pour devenir négatif était de 7-8 jours (23-24 jours après le début des symptômes). Il s’agit de la première étude publiée, randomisée, avec des contrôles pour tester le traitement à l’hydroxychloroquine seule. Cette étude a été réalisée en février 2020 : l’utilisation de l’hydroxychloroquine en mars-mai 2020 en France pose donc question. Cette étude n’exclue cependant pas un potentiel effet dû à l’ajout d’azithromycine et plus tôt (6 jours après le début des symptômes), qui reste à prouver.

Note ajoutée le 22 juillet 2020 : le 22 juillet est publiée une étude dans le journée Nature par des équipes françaises (parmi celles-ci, de l’IHU Méditerranée Infection et de l’Institut Pasteur) montrant une absence d’effet du traitement hydroxychloroquine+/-azythromycine sur la charge virale en comparant ce traitement à un placebo.

Note ajoutée le 1er novembre 2020 : le 20 octobre est publiée une étude dans le journal Nature Communications par des équipes norvégiennes montrant une absence d’effet sur la charge virale du traitement à l’hydroxychloroquine dans les premiers jours qui suivent le début des symptômes sur la charge virale en comparant ce traitement aux soins usuels (53 patients en tout).

Sources utilisées dans ce billet (modifications en gras) :

Lyngbakken et al., A pragmatic randomized controlled trial reports lack of efficacy of hydroxychloroquine on coronavirus disease 2019 viral kinetics, Nature Communications, 2020 (étude comparative – hydroxychloroquine versus soins usuels – chez 53 patients publiée par des équipes norvégiennes.

Maisonnasse et al., Hydroxychloroquine use against SARS-CoV-2 infection in non-human primates, Nature, 2020 (étude comparative – placebo versus traitement – chez le macaque, publiées par des équipes de l’Institut Pasteur (Paris), de l’Université Paris-Saclay, du CEA (Fontenay aux Roses & Kremlin Bicêtre), de l’Hôpital de la Timone et de l’IHU Méditerrannée Infection (Marseille), de l’Université Claude Bernard & de l’Ecole normale supérieure de Lyon et de l’Inserm)

Wei Tang et al., Hydroxychloroquine in patients with mainly mild to moderate coronavirus disease 2019: open label, randomised controlled trial, BMJ, 2020 (étude comparative – contrôles versus traités – après randomisation, comprenant 150 patients) ; cette étude avait été pré-publiée le 14 avril 2020 avec les mêmes conclusions quant à la charge virale

Gautret & Lagier et al., Clinical and microbiological effect of a combination of hydrochloroquine and azithromycin in 80 COVID-19 patients with at least a six-day follow-up: an observational study (seconde étude du Prof. Raoult concernant le COVID-19, qui consiste en un manuscrit non encore évalué par des pairs et non publié dans une revue scientifique ; publiée le 11 avril dans Travel Medicine and Infectious Disease, sans modification du Ct, on peut se demander pourquoi les relecteurs ne l’ont pas demandée)

Zhou, Yu, Du, Fan, Liu, Liu, Xiang et al., Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study, The Lancet, 2020 (étude rétrospective chinoise sur l’évolution des symptômes et de la charge virale chez les patients sans traitement)

Corman et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR, Euro Surveill., 2020 (méthode pour tester les patients)

Xu et al., Clinical features and dynamics of viral load in imported and non-imported patients with COVID-19, International Journal of Infectious Diseases, 2020 (une étude chinoise qui permet de lire le Matériel et Méthodes utilisé par ces laboratoires, qui ont participé à l’étude rétrospective)

Zou, Ruan, Huang, et al., SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients, N Engl J Med, 2020 (une étude de l’évolution de la charge virale chez quelques patients sans traitement)